本试剂盒中的组织裂解液能够快速裂解小鼠尾巴, 耳朵或脚趾等组织,释放出的基因组DNA无需提纯即可用于PCR扩增。试剂盒的 PCR 反应体系适用于扩增长度 <1.5kb 的靶序列,产生的平端 及黏端的PCR产物混合物可连接T载体或平端载体,方便进行测序确证。
1. 组织裂解
组织 | 建议组织使用量 |
小鼠尾尖 | 5mm~ 1cm |
小鼠耳朵 | 半只 |
小鼠脚趾 | 半只 |
a. 按照待裂解样品的数量配制1×组织裂解液,配制方法如下表。其中 Tissue Lysis Buffer 的成分有可能在低温下产生白色絮状沉淀,强烈建议实验前先确保该试剂已升至室温(25℃),沉淀完全溶解。
试剂 | 体积(每样品) |
Tissue Lysis Buffer | 200 μL |
Proteinase | 2 μL |
b. 向每个含有样品的EP管中加入新鲜组织裂解液,涡旋混匀后,65℃水浴裂解 30min 。 组织裂解时,务必将组织完全浸没于裂解液中。水浴结束后,组织块外观可能未能裂解完全,但足量的基因组DNA已经释放进入裂解液,不影响后续的PCR实验
c. 裂解完成后,将样品置于95℃或沸水浴中加热10min灭活Poteinase。
d. 将处理后的样品12000rpm离心5min ,取上清进行PCR实验,未使用的澄清透明上清可在-20℃保存一个月。
2. PCR 扩增
a. 反应体系:试剂盒的组分解冻后,上下颠倒混匀,在冰浴中配置以下25μL反应体系
裂解产物 | 1 μL |
引物 1(5μM) | 1 μL |
引物 2(5μM) | 1 μL |
2× PCR Mix | 12.5 μL |
ddH2O | 9.5 μL |
总体积 | 25 μL |
b. PCR程序
温度 | 时间 | 循环数 |
94℃ | 5 min | 1 |
94℃ | 30 s | |
55℃ | 30 s | 35 |
72℃ | 2 min | |
72℃ | 7 min | 1 |
c. 琼脂糖凝胶电泳
对PCR扩增产物进行琼脂糖电泳检测。