High Yield First-Strand cDNA Synthesis Kit 中使用的是经基因工程改造的逆转录酶，通过降低RNase H活性并增加热稳定性，使得该酶可以在比M-MLV更高的温度下合成第一链 cDNA，从而提供更高特异性和产量的cDNA。试剂盒合成的cDNA 产物适用于基因克隆、cDNA文库构建，以及定量PCR扩增等应用。
试剂盒组分：
High Yield RTase Mix (20×) | 1 × 20 μl |
RT Reaction Buffer (5×)* | 1 × 80 μl |
ddH2O (RNase and DNase free) | 1 × 1 ml |
*RT Reaction Buffer (5×) 包含的组份有：reaction
buffer, dNTPs, oligo (dT)18 and random primers。
实验步骤:
1. 将试剂组份置于冰上融解，融解后轻柔混匀，短暂离心后置于冰上保存。
2. 按照下表准备逆转录反应液，补水至终体积为 20μl。轻柔混匀准备好的逆转录反应液，短暂离心。
组份 | 体积 (μl) | 质量或 终浓度 |
High Yield RTase Mix (20×) | 1 | 1× |
RT Reaction Buffer (5×) | 4 | 1× |
Total RNA 或 PolyA RNA | 1 μg 或 10 ng | |
ddH2O (RNase/DNase free) | 补水至 20 μl |
注意事项：该试剂盒可检测低至 0.1 pg 的 RNA,以上表格中 RNA 质量为推荐的使用量，如果使用 Total RNA，使用量介于 10 ng ~ 5 µg，如果使用纯化的 poly A RNA， 使用量介于 1 ng.
3. 反转录反应程序设置
温度（℃） | 时间（分钟） |
25℃ | 5 |
42℃ | 15 |
85℃ | 5 |
4℃ | hold |
*通常，15 min 足以进行大多数 RNA 模板的逆转录反应。对于更复杂或更长的模板，可根据实际情况适当延长反应时间， 一般不超过 60 min。
4. 逆转录产物无需纯化即可直接用于下一步实验。对于反应体系 25μl 的 PCR 反应，建议使用 0.5μl ~ 2μl 未稀释的 cDNA。对于反应体系为 20μl 的 qPCR 反应，建议使用 2μl 1:5 ~ 1:20 稀释的 cDNA.
