2×Seamless Cloning Kit可将1~5个片段定向重组至载体中，可有效克隆50 bp~20 kb的片段到线性化载体中。将载体通过酶切或PCR 线性化，并在扩增片段正、反向PCR 引物5’端 引入15~25 bp同源序列，使得扩增产物之间以及扩增产物与线性化载体之间各有一段同源序列，各片段和线性化载体在重组酶的作用下，仅需50 ℃反应15~45 min即可进行转化，克隆 阳性率可达95%以上。

产品特点：

快速克隆：重组反应仅需15~45 min;

多片段克隆：线性化载体可有效组装1~5个片段；

高效：阳性率可达95%以上；

无缝：不引入额外的序列。

一、重组引物设计

在扩增片段正、反向PCR 引物5'端引入15~25bp同源序列，使得扩增产物之间以及扩增产物 与线性化载体之间各有一段同源序列。

二、制备线性化载体

需选择无重复序列且GC 含量均匀的区域进行克隆。

(1)酶切制备线性化载体

推荐载体优先选择双酶切线性化，单酶切次之，此外载体最好带有相应的筛选基因(如自杀基因CcdB), 避免空载影响阳性率。

(2)PCR 制备线性化载体

推荐使用高保真聚合酶进行载体扩增，可以通过DpnI酶处理扩增片段去除背景质粒。

三、插入片段制备

推荐选用高保真聚合酶扩增插入片段，无需考虑产物末端有无A尾，重组过程中将被去除。 PCR 扩增结束后，取少量产物进行琼脂糖凝胶电泳以检验扩增产量和特异性。如果PCR 产物 电泳条带单一，则扩增产物可以直接纯化，若扩增条带不单一，则需要切胶回收目的条带。 若扩增片段含有背景质粒则需要用Dpnl处理片段去除背景质粒，80℃失活Dpnl再用于重组实 验，载体和片段均扩增则无需失活DpnI直接用于重组。

四、载体片段和比例

载体和片段摩尔比为1:2~1:5,多片段重组时，各片段摩尔比为1:1。

摩尔比计算公式：

pmols=(质量ng×1000)/(片段长度bp×650 daltons)

(1)线性化载体装单个片段：10 μL 重组体系：线性化载体最适使用量=[载体碱基数/100]ng 0.015 pmol，片段最适使用量=[片段碱基数/50]ng 0.03 pmol

(2)线性化载体装2~5个片段：10 μL重组体系：载体最适使用量=[载体碱基数/100]ng 0.015 pmol，片段最适使用量=[各片段碱基数/50]ng 0.03 pmol

参考反应体系：

以10 μL重组体系计算，载体所需DNA 量为：载体碱基数除以100(ng), 片段所需DNA 量为： 片段碱基数除以50(ng)。若线性化载体长度为10kb, 浓度为100ng/μL, 片段长度为2 kb, 浓 度为40ng/μL。则重组体系如下：

五、重组反应

体系配制完成后，混匀各组分，短暂离心将反应液收集至管底。装1~2个片段50℃反应15~30 min。 装3~6个片段时，50 ℃反应30~45 min。 需在PCR仪或水浴锅等温控精确的仪器上进行反应。

六、重组产物转化、涂板

(1)在冰上解冻克隆感受态细胞

(2)取5~10 μL 冷却重组产物，加入到100 μL感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置15~30 min。

(3)42℃热激45~90 s, 冰浴2~5 min。

(4)加入约500 μL无 抗LB 培养基，37℃,200 rpm, 震荡培养30~60 min。

(5)取适当体积菌液均匀涂布在相应抗生素的平板上，平板倒置于37℃培养箱过夜培养。